کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ( HPLC )
ارسال شده: 31 مارس 2014 12:27
[CENTER]کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ( HPLC )
[/CENTER][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه "کروما" به معنی رنگ و "گروفین" به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیلسوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده میشود یکی از پرکاربردترین روشهای جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روشهای دیگر ناممکن است به راحتی میتوان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافاتهای جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی میشود. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، میتواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است.[/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER]
[/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
انواع کروماتوگرافی
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تبادل یونی
کروماتوگرافی جذب سطحی
کروماتوگرافی طردی
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000 مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند. به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.
کروماتوگرافی تبادل یونی
در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کننده کاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند. یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد
کروماتوگرافی جذب سطحی
در روش HPLC از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها
دارد.معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.
با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.
کروماتوگرافی طردی
روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کروماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد. [/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER][/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
میدان HPLC
فاز ساکن
فاز ساکن در HPLC در ستون هایی از جنس فولاد ضد زنگ به طول 10 -15-25-30-50- و یا 100 سانتی متر و با قطر 2-6 میلی متر پر می شود. عوامل موثردر انتخاب فاز ساکن HPLC عبارتند از : طبیعت مواد مورد تجزیه – راندمان جداسازی مورد نیاز – ظرفیت بارگذاری ستون .
از جاذب های جامد به عنوان فاز ساکن جهت جداسازی مولکولهای با جرم مولکولی نسبتا کم و با قطبیت کم استفاده می شود.سیلیکاژل متداولترین فاز ساکن جامد مورد استفاده در HPLC است.
آلومین , جامد جذاب دیگری است که در HPLC به کار می رود و چون یک ترکیب قلیایی است مواد اسیدی را بر روی خود نگه می دارد.
فاز متحرک
عموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیر هیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC کنترل نمود.فاز متحرک در HPLC باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند . معمولا مخلوطهای متانول , اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC مورد استفاده قرار می دهند. درHPLC فاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می شود.
انواع پمپ های دستگاه HPLC
پمپ های پیستونی
پمپ های جابه جایی یا سرنگی
پمپ های فشار ثابت یا بادی
وظیفه اصلی پمپ در کروماتوگرافی مایع این است که فاز متحرک را بافشار بالا با سرعت عبور کنترل شده , از ستون عبور دهد. یک نوع پمپ ( پمپ با فشار ثابت این عمل را با آوردن فشار ثابت به فاز متحرک انجام می دهدو سرعت عبورازستون
با توجه به مقاومت ستون در برابر عبور جریان و مقاومتهای دیگر موجود بین پمپ آشکارگر تعیین میشود. نوع دیگر این کار را با عبور جریان در حد خواسته شده انجام می دهد و در اینجا میزان فشار با توجه به مقاومت در برابر عبور تنظیم می گردد.
انواع ستون های دستگاه HPLC
ستون های کروماتوگرافی مایع
ستون های تجزیه ای
ستون های محافظ
ستون های کروماتوگرافی مایع معمولا از لوله های فولاد زنگ نزن با منفذ یکنواخت ساخته می شوند , گرچه لوله های شیشه ای یا جداره ضخیم نیز گاهی به کار می روند . لوله های شیشه ای با فشارهای کمتر از psi 600 محدود می شوند.
طول اکثر ستونهای کروماتوگرافی مایع 10 تا 30 سانتیمتر است. معمولا ستونها مستقیم اند و قطر داخلی ستونهای مایع اغلب 4 تا 10 سانتیمتر است و متداولترین ذرات پرکننده ها 5 و 10 میکرومتر است. متداولترین ستون در حال کار این روزها , ستونی با طول 25 میکرومتر پرشده است. و این ستونها می توانند 40000 تا60000 بشقابک در متر دارد.
ستون های محافظ اغلب یک ستون کوتاه محافظ است که قبل از ستون تجزیه ای به کار می رود تا با حذف نه تنها مواد آلاینده ها از حلالها , بلکه همچنین اجزای نمونه که بطور برگشت ناپذیر با فاز ساکن پیوند می دهند,عمر ستون تجزیه ای را افزایش دهد. همچنین در این روش ستون محافظ برای سیر کردن فاز متحرک با فاز ساکن به کار می رود تا اتلاف این حلال در ستون تجزیه ای را به حداقل برساند. اندازه ذرات در ستون بزرگ است تا افت فشار را به حداقل برساند.[/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER]
[/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
آشکارسازها
عامل وجودی آشکارگر در HPLC, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.
آشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.
آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذب UV – فلوئورسانس یا جریان نفوذ , که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.
انواع آشکارساز
آشکارسازهای جذبی
آشکارسارهای فلورسانسی
آشکارسازهای ضریب شکست
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
آشکارسازهای جذبی
آشکارگرهای جذب UV عمومی ترین آشکارگر HPLC به حساب می آیند. اصول کارکرد آن براین مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچک جاری میشود. محفظه در مقابل اشعه uv/visible منتشر شده از دستگاه نورسنج یاطیف سنج قرار میگیرد. این آشکارگرها انتخابگر بوده , فقط میتوانند اجزاء نمونه ای از نور uv را جذب می کنند آشکار سازند. و برای به حداقل رساندن پهن شدگی نواراضافی ستون , حجم چنین سلولی را تا حد امکان کوچک نگه می دارد. بنابراین حجمها به 1تا 10 میکرو لیتر و طول سلولها به 2 تا 10میلی لیتر محدود میشوند.
آشکارسازهای فلورسانسی
بسیاری از مواد میتوانند نورuv را جذب کرده و سپس اشعه ای در طول موج بالاتر پخش کنند. این پخش یا سریعاصورت میگیرد( فلورسانس) یا باکمی تاخیر (فسفرسانس) و معمولا نور جذب شده که دو مرتبه در طول موج بالاتر پخش میشودبسیار
کم است. اما برای بعضی مواد این میزان بین 1/0 تا1 می باشد. و این روش برای آشکار شدن این مواد مناسب میباشد . موادی که بطور طبیعی خاصیت فلورسانسی دارند دارای ساختمان حلقوی مزدوج هستند.
آشکار سازهای ضریب شکست
این آشکارگر برمبنای اختلاف ضریب شکست جزء نمونه خارج شده از ستون ضریب شکست فاز متحرک خالص ( به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زمانی که مابین جزء نمونه و فاز متحرک اختلاف شکست نور موجود باشد میتوان گفت که این آشکارگرها نزدیکترین وسیله در HPLC به عنوان آشکارگر جامع می باشند.
آشکارگرهای الکتروشیمیایی[/JUSTIFY ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]آشکارگرهای الکتروشیمیایی , هدایت مواد شسته شده را اندازه می گیرند و یا جریان بوجود آمده توسط اکسایش و احیاء جزء نمونه را تعیین می کنند در حالت اول جزء نمونه باید یونی باشد و در حالت دوم جزء نمونه باید براحتی اکسید یا احیاء گردد. نوع اول را آشکارگرهای سنجش رسانایی ویژه گویند .[/JUSTIFY ALIGN]
[/CENTER][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه "کروما" به معنی رنگ و "گروفین" به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیلسوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده میشود یکی از پرکاربردترین روشهای جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روشهای دیگر ناممکن است به راحتی میتوان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافاتهای جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی میشود. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، میتواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است.[/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER]
[/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]انواع کروماتوگرافی
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تبادل یونی
کروماتوگرافی جذب سطحی
کروماتوگرافی طردی
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000 مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند. به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.
کروماتوگرافی تبادل یونی
در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کننده کاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند. یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد
کروماتوگرافی جذب سطحی
در روش HPLC از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها
دارد.معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.
با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.
کروماتوگرافی طردی
روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کروماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد. [/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER][/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]
میدان HPLC
فاز ساکن
فاز ساکن در HPLC در ستون هایی از جنس فولاد ضد زنگ به طول 10 -15-25-30-50- و یا 100 سانتی متر و با قطر 2-6 میلی متر پر می شود. عوامل موثردر انتخاب فاز ساکن HPLC عبارتند از : طبیعت مواد مورد تجزیه – راندمان جداسازی مورد نیاز – ظرفیت بارگذاری ستون .
از جاذب های جامد به عنوان فاز ساکن جهت جداسازی مولکولهای با جرم مولکولی نسبتا کم و با قطبیت کم استفاده می شود.سیلیکاژل متداولترین فاز ساکن جامد مورد استفاده در HPLC است.
آلومین , جامد جذاب دیگری است که در HPLC به کار می رود و چون یک ترکیب قلیایی است مواد اسیدی را بر روی خود نگه می دارد.
فاز متحرک
عموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیر هیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC کنترل نمود.فاز متحرک در HPLC باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند . معمولا مخلوطهای متانول , اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC مورد استفاده قرار می دهند. درHPLC فاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می شود.
انواع پمپ های دستگاه HPLC
پمپ های پیستونی
پمپ های جابه جایی یا سرنگی
پمپ های فشار ثابت یا بادی
وظیفه اصلی پمپ در کروماتوگرافی مایع این است که فاز متحرک را بافشار بالا با سرعت عبور کنترل شده , از ستون عبور دهد. یک نوع پمپ ( پمپ با فشار ثابت این عمل را با آوردن فشار ثابت به فاز متحرک انجام می دهدو سرعت عبورازستون
با توجه به مقاومت ستون در برابر عبور جریان و مقاومتهای دیگر موجود بین پمپ آشکارگر تعیین میشود. نوع دیگر این کار را با عبور جریان در حد خواسته شده انجام می دهد و در اینجا میزان فشار با توجه به مقاومت در برابر عبور تنظیم می گردد.
انواع ستون های دستگاه HPLC
ستون های کروماتوگرافی مایع
ستون های تجزیه ای
ستون های محافظ
ستون های کروماتوگرافی مایع معمولا از لوله های فولاد زنگ نزن با منفذ یکنواخت ساخته می شوند , گرچه لوله های شیشه ای یا جداره ضخیم نیز گاهی به کار می روند . لوله های شیشه ای با فشارهای کمتر از psi 600 محدود می شوند.
طول اکثر ستونهای کروماتوگرافی مایع 10 تا 30 سانتیمتر است. معمولا ستونها مستقیم اند و قطر داخلی ستونهای مایع اغلب 4 تا 10 سانتیمتر است و متداولترین ذرات پرکننده ها 5 و 10 میکرومتر است. متداولترین ستون در حال کار این روزها , ستونی با طول 25 میکرومتر پرشده است. و این ستونها می توانند 40000 تا60000 بشقابک در متر دارد.
ستون های محافظ اغلب یک ستون کوتاه محافظ است که قبل از ستون تجزیه ای به کار می رود تا با حذف نه تنها مواد آلاینده ها از حلالها , بلکه همچنین اجزای نمونه که بطور برگشت ناپذیر با فاز ساکن پیوند می دهند,عمر ستون تجزیه ای را افزایش دهد. همچنین در این روش ستون محافظ برای سیر کردن فاز متحرک با فاز ساکن به کار می رود تا اتلاف این حلال در ستون تجزیه ای را به حداقل برساند. اندازه ذرات در ستون بزرگ است تا افت فشار را به حداقل برساند.[/JUSTIFY ALIGN][CENTER ALIGN=CENTER]
[/CENTER ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]آشکارسازها
عامل وجودی آشکارگر در HPLC, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.
آشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.
آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذب UV – فلوئورسانس یا جریان نفوذ , که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.
انواع آشکارساز
آشکارسازهای جذبی
آشکارسارهای فلورسانسی
آشکارسازهای ضریب شکست
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
آشکارسازهای جذبی
آشکارگرهای جذب UV عمومی ترین آشکارگر HPLC به حساب می آیند. اصول کارکرد آن براین مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچک جاری میشود. محفظه در مقابل اشعه uv/visible منتشر شده از دستگاه نورسنج یاطیف سنج قرار میگیرد. این آشکارگرها انتخابگر بوده , فقط میتوانند اجزاء نمونه ای از نور uv را جذب می کنند آشکار سازند. و برای به حداقل رساندن پهن شدگی نواراضافی ستون , حجم چنین سلولی را تا حد امکان کوچک نگه می دارد. بنابراین حجمها به 1تا 10 میکرو لیتر و طول سلولها به 2 تا 10میلی لیتر محدود میشوند.
آشکارسازهای فلورسانسی
بسیاری از مواد میتوانند نورuv را جذب کرده و سپس اشعه ای در طول موج بالاتر پخش کنند. این پخش یا سریعاصورت میگیرد( فلورسانس) یا باکمی تاخیر (فسفرسانس) و معمولا نور جذب شده که دو مرتبه در طول موج بالاتر پخش میشودبسیار
کم است. اما برای بعضی مواد این میزان بین 1/0 تا1 می باشد. و این روش برای آشکار شدن این مواد مناسب میباشد . موادی که بطور طبیعی خاصیت فلورسانسی دارند دارای ساختمان حلقوی مزدوج هستند.
آشکار سازهای ضریب شکست
این آشکارگر برمبنای اختلاف ضریب شکست جزء نمونه خارج شده از ستون ضریب شکست فاز متحرک خالص ( به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زمانی که مابین جزء نمونه و فاز متحرک اختلاف شکست نور موجود باشد میتوان گفت که این آشکارگرها نزدیکترین وسیله در HPLC به عنوان آشکارگر جامع می باشند.
آشکارگرهای الکتروشیمیایی[/JUSTIFY ALIGN][JUSTIFY ALIGN=CENTER]آشکارگرهای الکتروشیمیایی , هدایت مواد شسته شده را اندازه می گیرند و یا جریان بوجود آمده توسط اکسایش و احیاء جزء نمونه را تعیین می کنند در حالت اول جزء نمونه باید یونی باشد و در حالت دوم جزء نمونه باید براحتی اکسید یا احیاء گردد. نوع اول را آشکارگرهای سنجش رسانایی ویژه گویند .[/JUSTIFY ALIGN]