آنالیز دستگاهی انواع کروماتوگرافی و نحوه عمل آنها

[hses]

آنالیز دستگاهی انواع کروماتوگرافی و نحوه عمل آنها

قبل از تعیین ویژگی ها و فعالیت های شیمایی یک پروتئین باید ابتدا ان را خالص سازی کنیم . همان طور که اطلاع دارید سلول از هزاران نوع پروتئین تشکیل شده است ولی چگونه این پروتئین ها را می توانیم به صورت خالص تهیه کنیم ؟؟!! جداسازی پروتئین ها به ویژگی های مخصوص هر پروتئین مانند اندازه ، بار الکتریکی و نحوه اتصال انها وابسته است . منبع یک پروتئین معمولا کشت های میکروبی و یا بافت است . اولین مرحله در خالص سازی پروتئین ها شکست سلول و آزاد کردن آنها در یک محلول به نام crude extract (عصاره خام) می باشد .
سانتریفیوژ افتراقی هم در صورت لزوم برای جداسازی محلول های فراسلولی و یا جداسازی ساختار های خاص سلولی استفاده می شود . زمانی که عصاره پروتئین از سلول استخراج شد از روش های مختلفی می توان برای جداسازی و خالص سازی پروتئین(های) تشکیل دهنده محلول استفاده کرد. معمولا از عصاره ، در زمینه درمانی استفاده می شود که پروتئین ها را بر اساس اندازه و یا بار به قسمت های مختلفی جداسازی می کنیم که به این روش “جزء به جزء کردن” یا fractionation می گویند . مراحل اولیه خالص سازی پروتئین جدا از حلالیت پروتئین است و به دما ، غلظت نمک ، PH و سایر فاکتور ها وابسته است . میزان انحلال پذیری پروتئین در غلظت بالای نمک کمتر است که به این خاصیت پروتئین ها ” salting out ” می گویند (معادل مناسبشو نتوسنتم پیدا کنم!) افزودن مقدار معینی از نمک رسوب برخی از پروتئین ها را انتخاب می کند در حالی که رسوب برخی از آنها باقی خواهد ماند .

آمونیوم سولفات به علت قابلیت حل بالا در آب ، ترکیبی است که برای این منظور مورد استفاده قرار می گیرد . قوی ترین روش برای جداسازی جزء به جزء پروتئین ها کروماتوگرافی ستونی است که می تواند پروتئین ها را بر اساس بار الکتریکی ، اندازه ، قدرت پیوند و … جداسازی کند . ماده جامد متخلخل با ویژگی های شیمیایی خاص (فاز ساکن) در ستونی تعیبه می شود و محلول بافری (فاز متحرک) از میان آن تراوش می شود . محلول حاوی پروتئین در بالای ستون به صورت لایه ای اندوده می شود و سپس به داخل ماتریکس فاز ساکن تراوش می کند و با گسترش محلول باندهایی را در داخل فاز ساکن ایجاد می کند . برخی از پروتئین ها بر اساس ویژگی های آنها به سرعت و یا به کندی در ستون سیر می کنند.
به طور مثال در کروماتوگرافی تعویض کاتیونی ، فاز جامد دارای بار الکتریکی منفی است . در فاز متحرک ، پروتئین ها با بار الکتریکی خالص مثبت با سرعت کمتری نسبت به پروتئین های دارای بار الکتریکی خالص منفی حرکت می کنند به این علت که میزان مهاجرت به برهمکنش فاز ساکن و پروتئین وابسته است . دو پروتئین میتواند به دو باند مجزا جدا شود . وسعت باند پروتئین در فاز متحرک (محلول پروتئینی) به دو عامل نوع خصوصیت جداسازی پروتئین و نحوه تقسیم انتشار وابسته است . هر چه قدر طول ستون کروماتوگرافی بزرگتر شود دقت جداسازی دو پروتئین با بار الکتریکی خالص متفاوت بیشتر خواهد شد . اگرچه میزان سیر محلول پروتئینی در ستون با افزایش طول ستون کاهش خواهد یافت و میزان زمانی که محلول در ستون خواهد بود بیشتر می شود .

اساس کار
کروموتوگرافی یک روش فیزیکی است که ترکیبات یک محلول ساده را براساس توزیع متفاوت بین فاز ثابت و متحرک جدا می کند . براساس این روش ، فاز متحرک ، نمونه را در یک سطح ، لایه و یا یک ستون حاوی فاز ثابت ، با خود حمل می کند . با عبور و سیر فاز متحرک در مجاورت فاز ثابت ، چند حالت زیر برای ترکیبات محلول اتفاق خواهد افتاد :
بر روی فاز ثابت مستقر می شود (بدون مهاجرت) .
بر روی فاز متحرک مستقر می شود (مهاجرت همراه با فاز متحرک).
بین دو فاز پخش می شود (مهاجرت متفاوت).
ذراتی که دارای میل زیادی نسبت به فاز ثابت هستند در فاز ثابت مستقر می شوند و نسبت به سایر ذرات که دارای میل کمتری هستند با سرعت کمی مهاجرت می کنند . ذرات دارای میل کمتر در روی فاز متحرک مستقر می شوند و با سرعت بیشتر مهاجرت می کنند . بدین صورت ذرات جدا شده از محلول که دارای میل کمتری نسبت به محلول هستند دارای میل زیادی نسبت به فاز ثابت هستند . ذرات با پیوند های قوی به فاز ساکن متصل می شوند سپس با تغییر خصوصیات فیزیکی و یا ویژگی های طبیعی شیمیایی فاز متحرک ، ذرات از محل خود در فاز ثابت جابه جا می شوند.
کروماتوگرافی به دو گروه اصلی ستونی و سطحی تقسیم بندی می شود . در کروماتوگرافی سطحی ، فاز ساکن بر روی یک صفحه کاغذ اندوده می شود (کروماتوگرافی کاغذی) و یا اینکه به یک سطح جامد متصل می شود (thin-layer chromatography [TLCI) . در کروماتوگرافی کاغذی ، فاز ساکن (ثابت) یک لایه از آب و یا حلال قطبی است که بر روی فیبر کاغذی اندوده شده است . در TLCI ، لایه نازکی از یک ماده خاص مانند ژل سیلیکا بر روی یک صفحه شیشه ای یا لایه آلومینیومی و یا پلاستیکی به طور یکنواخت پخش شده است . زمانی که ضخامت لایه ها نازک به کمترین حالت ممکن برسد (۴٫۵ میکرومتر) در این صورت به این روش کروماتوگرافی HPTLC یا کروملتوگرافی لایه نازک فشار بالا گفته می شود .
در کروماتوگرافی ستونی ، فار ثابت می تواند سلیکای خالص و یا پلیمر و یا اندوده شده در داخل آن و یا به صورت پیوند شیمیایی متصل به آن باشد . ممکن است فاز ساکن به صورت “بسته ای” در داخل تیوبی و یا اندوده شده در سطح داخلی فضای تیوب باشد . کروماتوگرافی ستونی اگر دارای فاز متحرک گازی و یا مایع باشد، کروماتوگرافی گازی و یا کروماتوگرافی مایع نامگذاری می شود . زمانی که در کروماتوگرافی مایع ، ضخامت ذرات فاز ساکن بسیار کمتر باشد به آن HPLC می گویند . زمانی که کروماتوگراف مایع و یا گازی به یک دستگاه طیف سنج متصل می شود ، دو تکنیک با هم ترکیب می شوند و در فاز گازی GC-MS و در فاز مایع (LC-MS ) نام گذاری می کنیم .

در کروماتوگراف تحلیلی GC و LC فاز متحرک یا شوینده از ستون خارج می شود و از جلوی حس گری عبور میکند که باعث تولید و رسم سیگنال های الکترونیکی براساس مسافت ، زمان و حجم میشود . رسم به دست امده بدین صورت کروماتوگرام (chromatogram )نامیده می شود . زمان بازداری و یا حجم محلول زمانی است که محلول از انژکتور خارج شده و به ستون ترزیق می شود و از میان ستون و حسگر عبور می کند . اطلاعاتی که توسط کروماتوگرام به دست میاید برای جداسازی و شناسایی ترکیبات محلول استفاده خواهد شد . از آنجا که ذرات شستشو شده به صورت قله های سری (پیک در نمودار) گرافیکی دیده می شوند . تکرار آنها تحت عنوان پیک کروماتوگرافیک خواهد بود . این پیک ها با ارتفاع ، عرض و مساحت تعریف می شوند . در کروموتوگرافی سطحی و یا کاغذی ، مناطق جداشده بر اساس رنگ های طبیعی آنها و یا با استفاده از اصلاح کننده های شیمیایی به صورت نکته و یا باند های رنگی شناسایی می شوند .

مکانیزم جداسازی در کروماتوگراف
جداسازی پروتئین در کروماتوگراف به دو کلاس شیمیایی و فیزیکی انجام می شود شامل : تعویض یونی ، تفکیک کردن ، جذب سطحی ، انتخاب بر اساس اندازه و مکانیسم پیوستگی می باشد . در مراحل اولیه پیدایش کروماتوگرافی علوم آزمایشگاهی ها از دو روش تغییر یونی و همچنین مکانیسم تفکیکی یا پارتیشنی استفاده می کردند .

کروماتوگرافی تعویض یونی
کروماتوگرافی تعویض یونی بر اساس تغییر یونها استوار است . در این روش بار سطح ثابت (فاز ثابت) با بار مخالف خود در فاز متحرک ، تعویض می شود . بر اساس شرایط ، مواد محلول کاتیون (بار مثبت) و یا انیون (بار منفی) هستند . آنها بر اساس باریونی متفاوت خود و یا بر حسب مقدار بار یونی جدا می شوند . سطح ظریفی از رزین و یا سلیکا میتواند فاز ساکن را در این نوع کروماتوگراف تشکیل دهد کاتیون و یا انیون ها در این حالت بر روی فاز ساکن اندوده می شود و یا با پیوند شیمیایی به آن (فاز ساکن) متصل می شود . برای حفظ بار الکتروشیمیایی با تعویض یون ها ، counterion در نزدیکی فاز ساکن تعبیه می شود . یون های محلول در فاز متحرک با counterion تعویض بار می شوند سپس یون های محلول با تغییر ph ، قدرت یونی و یا هر دو فاز متحرک شسته و انتخاب می شوند .
تعویض کاتیونی ، حاوی دسته از بار های منفی است که برای جداسازی و یا “تعویض” ذرات کاتیونی استفاده می شود . (یعنی ذراتی محلولی که دارای بار مثبت هستند) . برای نمونه : اسید های قوی مانند یون های سولفونات و اسید های ضعیف مانند یونهای کربوکسیلات ، کربوکسی متیل ، فسفات ، سولفومتیل ، سولفواتیل و یا سولفوپروپیل .
تعویض انیونی برای جداسازی محلول های آنیونی مورد استفاده قرار می گیرد . انها دارای آمین های تترامری هستند که دارای بار مثبت هستند . برای نمونه : تری تیلامینواتیل و یا گروه های ضعیف مانند آمینواتیل ، دی اتیل آمینواتیل ، گوانیدواتیل ، اپی کلرودین-تریتانول آمین .
کروماتوگرافی تعویض یونی دارای استفاده های گوناگونی در زمینه تشخیص بیماری است . جداسازی امینواسیدها ، جداسازی پپتیدها ، جداسازی پروتئین ها ، جداسازی نوکلئوتیدها و الیگونوکلئوتیدها و نوکلئیک اسید در آزمایشگاه تشخیص طبی بر اساس این روش انجام می گیرد . جداسازی یون های غیرآلی از مخلوط های آبکی یکی دیگر از استفاده های مهم کروماتوگرافی تعویض یونی است . برای مثال ، آب دیونیزه ، با استفاده از ستون های رزینی کاتیونی و آنیونی به دست می آید .

کروماتوگرافی پارتیشنی (تفکیکی)
توزیع متفاوت ذره حل شونده در دو مایع غیر قابل مخلوط با هم اساس کروماتوگرافی تفکیکی است . مایع مخلوط ناشدنی اولی نقش فاز ساکن را دارد . برای تهیه این فاز ، لایه نازکی از مایع با پیوند شیمیایی و یا با جذب سطحی بر روی ذره مورد نظر و یا داخل دیواره ستون موئینه ای اندوده می شود . جداسازی بر حسب تفاوت در قابلیت حل مولکول های محلول بین فاز ساکن و فاز متحرک انجام می گیرد . کروماتوگرافی تفکیکی همچنین به دو دسته gas-liquid chromatograohy و liquid – liquid chromatography تقسیم بندی می شود . LLC هم خودش به دو نوع فاز نرمال و یا فاز معکوس تقسیم بندی می شود . در LLC فاز نرمال ، مایع قطبی (از نظر بار) به عنوان فار ساکن استفاده می شود و یک حلال غیرقطبی به عنوان فاز متحرک خواهد بود . در کروماتوگرافی LLCفاز معکوس ، فاز ساکن غیر قطبی است در حالی که فاز متحرک قطبی است . توقف – یونی و کروماتوگرافی جفت – یونی دو فرم از کروماتوگرافی فاز معکوس LLC هستند که برای جداسازی ذرات محلول مورد استفاده قرار می گیرد . در کروماتوگرافی توقف – یونی بخش یونی باز و یا اسید ضعیف یا خنثی می شود و یا با تغییر میزان PH فاز متحرک،ساپرس (متوقف ) می شود . با خنثی سازی گروه یونی ، محلول دارای قطبیت کمی خواهد بود و در نتیجه قابلیت متصل شده به فاز ساکن غیر قطبی در ان بیشتر می شود . ذرات ساپرس شده هم وی‍گی های همانند ذرات خنثی دارند و با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس جدا می شوند . از کروماتوگرافی جفت – یونی هم برای جداسازی داروهای درمانی و متابولیسم آنها استفاده می کنیم .

کروماتوگرافی جذب سطحی
اساس این نوع کروماتوگرافی هم بر اساس تفاوت در جذب سطحی و یا عدم جذب سطحی بر روی ذره ای جامد است . نیرویهای الکترواستاتیک و همچنین پیوند یونی برهمکنش های فیزیکی هستند که این نوع کروماتوگرافی را کنترل می کنند . در GC از این متد برای جداسازی ترکیبات دارای وزن مولکولی کم (مانند : متیل ، اتیل ، الکلهای ایزوپروپیل) و همچنین ترکیباتی که دارای فاز گازی در دمای اتاق هستند استفاده می کنیم .

کروماتوگرافی انتخاب بر اساس اندازه
Size-exclusion chromatography همچنین به نام های فیلتراسیون ‍‍‍ژل ، تراوش ژل ، ممانعت مولکولی و کروماتوگرافی مولکولی مشهور است . اساس این نوع کروماتوگرافی بر جداسازی ذرات بر اساس اندازه های مولکولی انها استوار است . شکل مولکولی و هیدارته شدن انها فاکتورهای تاثیر گذار در این نوع کروماتوگرافی است . مواد گوناگونی به عنوان فاز ثابت در این روش مورد استفاده قرار می گیرد . مثلا : دکستران کراس لینک ، پلی آکریل آمید ، آگاروز ، پلیسترین و … . با کنار هم قرار گرفتن این مواد خلل و فرج های بسیار کوچک موقتی ایجاد می شود که می تواند مولکول های کوچک را موقتا به دام بیندازد . مولکول ها با اندازه بزرگ در فاز متحرک باقی می مانند و به سرعت از ستون شستشو داده می شوند . از این نوع کروماتوگرافی برای مقاصد تحقیقاتی و تجزیه ای استفاده می شود .

کروماتوگرافی پیوسته
در این نوع از کروماتوگرافی ، از برهم کنش های ویژه و اختصاصی بیولوژی برای جداسازی ذرات استفاده می کنیم .پیوند آنزیم – سوبتسرا ، هورمون – گیرنده و یا آنتی ژن – آنتی بادی در این نوع از کروماتوگرافی استفاده می شود . اهمیت این تکنیک در قدرت بالای انتخاب آن است . در آزمایشگاه از این روش برای جداسازی هموگلوبین های گلیکوزیله (ستون فنیل برونات – phenyl boronate columns ) ولیپوپروتئین های LDL و VLDL (ستون هپارین) استفاده می شود . همچنین از این روش برای تهیه پروتئین ها و آنتی بادی ها در مقادیر کمی زیاد برای مقاصد تحقیقاتی بهره می بریم .